1、PCR?實驗室的潛在污染來源
①臨床標(biāo)本中存在的大量待測微生物或待測靶核酸
②科研中得到的質(zhì)??寺?
③以前分析研究的特定微生物或靶核酸
④大量存在于實驗環(huán)境中的特定微生物或靶核酸
⑤以前擴增產(chǎn)物的殘留污染,這也是?PCR?實驗室最容易產(chǎn)生的將造成假陽性的“污染”。?
PCR擴增可以引起實驗室中擴增產(chǎn)物的累積,通常一次典型的PCR?擴增可以產(chǎn)生109拷貝的靶序列,如果氣溶膠化,甚至最小的氣溶膠都會含有106拷貝的擴增產(chǎn)物。如果不加以控制,在短期內(nèi)累積的氣溶膠化的擴增產(chǎn)物即會污染實驗室中的試劑、儀器設(shè)備和通風(fēng)系統(tǒng),從而造成嚴(yán)重的實驗室“污染”,出現(xiàn)大量的假陽性結(jié)果。
2、PCR?實驗室的防污染措施
進行PCR操作時,操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程,最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。
(一)?劃分操作區(qū)
目前,普通PCR尚不能做到單人單管,實現(xiàn)完全閉管操作,但無論是否能夠達(dá)到單人單管,均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進行,PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進行:
1.??試劑準(zhǔn)備區(qū)。
2.標(biāo)本制備區(qū)。
3.??PCR擴增區(qū)及分析區(qū)。
各工作區(qū)要有一定的隔離,操作器材專用,要有一定的方向性。如:試劑準(zhǔn)備→標(biāo)準(zhǔn)制備→PCR擴增區(qū)及分析區(qū)。
切記:任何一間的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。
(二)?分裝試劑
PCR擴增所需要的試劑均應(yīng)在生物安全柜、裝有紫外燈的超凈工作臺或負(fù)壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中,不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA:
1.PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水;
2.引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產(chǎn)物區(qū)配制;
3.引物和dNTP應(yīng)分裝儲存,分裝時應(yīng)標(biāo)明時間,以備發(fā)生污染時查找原因。
(三)?實驗室的嚴(yán)格分區(qū)及工作程序的嚴(yán)格遵守
試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本準(zhǔn)備區(qū)、擴增區(qū)、檢測區(qū)等必須備有其各自必需的儀器設(shè)備、工作服、手套、加樣器和通風(fēng)系統(tǒng)。在每個區(qū)使用的試劑和廢物,必須直接在其各自的區(qū)域內(nèi)分裝或包裝。操作人員必須注意防止通過他們的頭發(fā)、眼鏡、首飾和衣服將擴增產(chǎn)物從污染區(qū)攜帶至清潔區(qū)的可能性。
(四)化學(xué)方法
實驗臺面可使用10%的次氯酸鈉(漂白劑)清洗,然后再用70%乙醇或清水洗去次氯酸鈉。次氯酸鈉具有氧化損傷核酸的作用,從而使可能的留在實驗臺面的擴增產(chǎn)物被破壞掉。要注意的是,次氯酸鈉不能區(qū)分提取的目的?DNA?和?PCR?擴增產(chǎn)物,用次氯酸鈉處理的樣本不能用于核酸擴增檢測。在實際工作中,有些物品比如放置擴增反應(yīng)管的盤必須從污染區(qū)轉(zhuǎn)回到清潔區(qū)時,在轉(zhuǎn)回之前,應(yīng)將其置于2%~10%的次氯酸鈉溶液中過夜,并充分沖洗。
(五)擴增產(chǎn)物的修飾
如對以前擴增產(chǎn)物進行適當(dāng)修飾,應(yīng)可以消除其污染后面新的擴增檢測,但為保證不影響靶核酸的擴增檢測,擴增產(chǎn)物修飾方法必須遵循兩個基本原則:
一是擴增產(chǎn)物被修飾后,應(yīng)可以與隨后打增的靶序列區(qū)分。
二是修飾不能干擾正常的擴增檢測。
不同消除擴增產(chǎn)物污染的方法優(yōu)缺點比較
圖片來自《實時熒光PCR技術(shù)》
(六)?實驗操作注意事項
盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因,樣品間的交叉污染也是原因之一。因此,不僅要在進行擴增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真,在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意:
1.??戴一次性手套,若不小心濺上反應(yīng)液,立即更換手套;
2.??使用一次性吸頭,嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用,吸頭不要長時間暴露于空氣中,避免氣溶膠的污染;
3.??避免反應(yīng)液飛濺,打開反應(yīng)管時為避免此種情況,開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上,應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;
4.??操作多份樣品時,制備反應(yīng)混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然后分裝,這樣即可以減少操作,避免污染,又可以增加反應(yīng)的精確度;
5.??最后加入反應(yīng)模板,加入后蓋緊反應(yīng)管;
6.??操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照,即可驗證PCR反應(yīng)的可靠性,又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性;
7.??盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器,由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染,最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器,至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用,不能交叉使用,尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū);
8.??重復(fù)實驗,驗證結(jié)果,慎下結(jié)論。
3、實驗室污染的監(jiān)測
一個好的實驗室,要時刻注意污染的監(jiān)測,考慮有無污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。
對照試驗
(1)陽性對照:在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照,它是PCR?反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標(biāo)志。陽性??對照要選擇擴增度中等、重復(fù)性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本,如以重組質(zhì)粒為陽性對照,其含量宜低不宜高(100個拷貝以下)。但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本,其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大.因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)??定,檢驗人員心中有數(shù)時,在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照。
(2)陰性對照:每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括①標(biāo)本對照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增,以監(jiān)測試劑是否污染。
(3)重復(fù)性試驗
(4)選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增
4、實驗室污染的消除
實驗室一旦發(fā)生污染,檢測工作應(yīng)立即停止,直到確認(rèn)消除污染后才能重新開始檢測。首先,要查找污染源和明確污染范圍。然后,根據(jù)污染源和污染范圍采取有效的去污染措施,結(jié)合各種不同方法以達(dá)到最佳效果。
(1)標(biāo)本污染生物安全柜的操作臺造成局限污染時:
立即用吸水紙覆蓋,并使用0.55%含氯消毒劑進行噴灑消毒。消毒液需要現(xiàn)用現(xiàn)配,24小時內(nèi)使用。
(2)標(biāo)本傾覆造成實驗室污染時:
保持實驗室空間密閉,避免污染物擴散。立即使用潤濕有0.55%含氯消毒劑的毛巾覆蓋污染區(qū)。必要時(如大量溢撒時)可用過氧乙酸加熱熏蒸實驗室,劑量為2g/m3,熏蒸過夜;或20g/L過氧乙酸消毒液用氣溶膠噴霧器噴霧,用量8ml/m3,作用1-2小時;必要時或用高錳酸鉀-甲醛熏蒸:高錳酸鉀8g/m3,放入耐熱耐腐蝕容器(陶罐或玻璃容器),后加入甲醛(40%)10ml/m3,熏蒸4小時以上。熏蒸時室內(nèi)濕度60%-80%。
(3)清理污染物時:
嚴(yán)格遵循活病毒生物安全操作要求,采用壓力蒸汽滅菌處理,并進行實驗室換氣等,防止次生危害。
5、新冠病毒核酸檢測常見問題
(1)新冠試劑出現(xiàn)翹尾,怎么處理?
答:如果是個別單一通道翹尾,不管是FAM還是VIC通道,首先按照要求復(fù)查,復(fù)查建議重新采樣,如果不方便重新采樣建議對原有樣本進行重新提取核酸驗證,如果復(fù)查陰性判讀陰性,如果復(fù)查還是同一通道翹尾,就要對結(jié)果仔細(xì)審核,一是要排除實驗室污染,二是要對病人信息了解清楚,從臨床癥狀及接觸史排查,如果沒法確認(rèn),建議必須重新采樣復(fù)查,如有必要可以采用另一家試劑來驗證。如果出現(xiàn)大量的弱陽性擴增翹尾,首要原因是考慮實驗室污染,可以通過做環(huán)境樣本和陰性對照做驗證排除。
(2)N基因和1ab基因是新冠病毒的特有基因嗎,靈敏度哪個更高?是否會和其他冠狀病毒片段重疊?
答:N基因跟1ab都是特異的,不會跟其他呼吸道病原體交叉反應(yīng)。設(shè)計時候,兩個基因的序列不一樣,導(dǎo)致靈敏度不一樣,N基因的靈敏度比1ab靈敏度高。
(3)新冠檢測結(jié)果和臨床診斷不符合,怎么解讀?
答:新冠病毒由于是RNA病毒,容易降解,另外檢測結(jié)果也和取樣,核酸提取以及樣本本身的核酸濃度有關(guān),需要逐一分析,同時可以結(jié)合臨床癥狀判讀。
(4)采用生理鹽水做陰性對照,內(nèi)標(biāo)也會增長,怎么解釋?
答:因為試劑采用的是內(nèi)源性內(nèi)標(biāo),內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)是用人源基因標(biāo)記,此基因存在于人的表皮細(xì)胞內(nèi),操作過程中就可能會出現(xiàn)人源性的污染,另外環(huán)境污染也有可能導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)增長,這也是前面提到的建議做環(huán)境樣本質(zhì)控。
(5)新冠樣本內(nèi)標(biāo)不出如何處理?
答:如果新冠樣本內(nèi)標(biāo)不出,該樣本必須復(fù)查,可重新混勻該樣本提取核酸,如果重新提取該樣本內(nèi)標(biāo)還是不出,在排除提取問題的情況下,說明采樣不合格,要通知臨床重新采樣復(fù)查。
(6)采集環(huán)境樣本檢測新冠狀病毒,為啥大部分樣本內(nèi)標(biāo)不出,偶爾個別樣本檢測出內(nèi)標(biāo)?
答:因為新冠試劑檢測的是人內(nèi)源性內(nèi)標(biāo),環(huán)境樣本一般不含有人源細(xì)胞,所以檢測不出內(nèi)標(biāo);偶爾檢出內(nèi)標(biāo),可能該環(huán)境樣本上有人源性細(xì)胞粘附,故而檢出內(nèi)標(biāo)。
最后是兩條有用的小訣竅:
●?面對多份樣品,制備反應(yīng)混合液時,先將?dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然后用分液功能進行分裝。
●?在加入模板時,按照“陰性對照-待測樣品-陽性對照”的加樣順序,操作上應(yīng)遵循“開管蓋-加模板-蓋管蓋”的原則。
—END—
來源:我是質(zhì)控人